3 spôsoby výroby fosfátového tlmivého roztoku

Fosfátový tlmivý roztok (PBS) je slaná zmes používaná v biologickom výskume. Používa sa na riedenie skupiny buniek alebo na oddelenie buniek. Tento tlmivý roztok udržiava stabilné pH, aby sa bunky počas pozorovania a skladovania nezničili. Môžete pripraviť 1X roztok, ktorý sa môže použiť priamo na bunky, alebo môžete pripraviť 10X zásobu, ktorá sa môže zriediť na 1X. Ak sa vo vašom laboratóriu používa veľa PBS, možno by bolo dobré pripraviť 10x zásobu, pretože vydrží dlhšie.

Metóda 1 z 3:Výroba 1X vývaru


Zhromaždite si materiály a prísady. Na prípravu 1X (bežná koncentrácia používaná pri experimentoch) roztoku fosfátového tlmivého roztoku (PBS) budete potrebovať 1-L odmerný valec, váhy, 2-L kadičku, miešadlo, miešaciu dosku, pH meter, autokláv a sklenenú fľašu na skladovanie. Na výrobu 1 l PBS budete potrebovať nasledujúce množstvá jednotlivých zložiek: [1]

  • Malé množstvo zriedenej HCl a/alebo NaOH na dosiahnutie pH konečného roztoku
  • 800 ml destilovanej vody
  • 8 g NaCl (chlorid sodný)
  • 0.2 g KCl (chloridu draselného)
  • 1.44 g Na2HPO4 (fosforečnan disodný)
  • 0.24 g KH2PO4 (fosforečnan draselný)
  • Konečná koncentrácia každej zlúčeniny by mala byť 137 mm NaCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl a pH 7.4.[2]


Umiestnite miešadlo do kadičky a položte kadičku na hornú časť miešacej dosky. Pri výrobe akéhokoľvek roztoku chcete, aby sa roztok neustále pohyboval. To pomôže všetkému, aby sa rýchlejšie rozpustilo. Aby ste sa vyhli rozstrekovaniu po pridaní vody, umiestnite miešadlo do prázdnej kadičky a potom ho položte na miešaciu platňu.[3]

  • Miešacia tyč obsahuje magnet, ktorý umožňuje tyči otáčať sa a miešať roztok, keď sa nádoba s kvapalinou umiestni na miešaciu dosku, ktorá obsahuje motor.[4]
  • Pred zapnutím počkajte, kým bude v kadičke roztok.


Odmerajte 800 ml destilovanej vody do 2-litrovej kadičky, potom zapnite miešacie platne. Pri príprave roztoku začnite s menším objemom vody, ako je konečný objem. Na konci pridáte zvyšok vody, aby celkový objem dosiahol 1 l. Pomocou odmerného valca odmerajte 800 ml vody a nalejte ju priamo do čistej kadičky.[5]

  • S vodou v kadičke zapnite miešadlo na strednú rýchlosť. Mali by ste vidieť, ako sa vo vode vytvorí malý vír, keď sa miešadlo začne otáčať.


Odvážte správne množstvo každej chemikálie. Odvážte 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, a 0.24 g KH2PO4. Použite váhy na odváženie každej chemickej látky po jednej v ich vlastných váhach.[6]

  • Ak pridáte príliš veľa chemikálie, jednoducho odstráňte prebytok, kým nebudete mať správne množstvo.


Pridajte všetky chemikálie do roztoku a rozpustite ich. Počas miešania nalejte každú chemikáliu do vody. Na pridávanie jednotlivých zložiek nie je stanovené žiadne špeciálne poradie, takže môžete pridať všetko naraz. Nechajte všetko pokračovať v miešaní, kým sa úplne nerozpustí.[7]

  • Môžete to nechať stáť, kým budete robiť niečo iné, a skontrolovať to neskôr. Rozpustenie bude trvať najmenej 5 až 10 minút.


Upravte pH roztoku na 7.4. Keď sa všetko úplne rozpustí, musíte upraviť pH tlmivého roztoku na hodnotu 7.4.[8]
Miešadlo nechajte zapnuté a pH meter umiestnite do hornej časti roztoku. Nechajte čísla na pH metri sa prestanú pohybovať. Roztok bude pravdepodobne príliš kyslý, takže budete musieť pridať hydroxid sodný (NaOH) na úpravu pH.

  • Pomocou malej pipety pridávajte NaOH po niekoľkých kvapkách. Po každom pridaní nechajte roztok chvíľu miešať a skontrolujte nový údaj na pH-metri.
  • Úprava pH roztoku je proces, ktorý si vyžaduje trpezlivosť. Ak náhodou prekročíte hodnotu 7.4, môžete pridať niekoľko kvapiek kyseliny chlorovodíkovej (HCl), aby sa teplota opäť znížila.


Dopĺňajte vodu, kým nebude mať roztok 1 liter. Po správnej úprave pH môžete roztok doplniť na konečný objem 1 l. Opatrne prelejte celý roztok z kadičky do 1 l odmerného valca. Pridajte dostatočné množstvo destilovanej vody, aby bol objem 1 l.[9]

  • Konečný roztok nalejte do sklenenej fľaše s objemom 1 l, ktorá je vhodná na autoklávovanie.


Sterilizujte roztok v autokláve. Na fľašu nasaďte viečko, ale nezaskrutkujte ho. Počas autoklávovania môže tlak vo fľaši narásť a explodovať, ak utiahnete viečko. Cez veko dajte pás autoklávovacej pásky, aby držalo na mieste počas autoklávovania.[10]

  • Nastavte autokláv na 20 minút sterilizácie pri tlaku 15 psi v cykle kvapaliny.[11]
  • Autoklávovacia páska má v sebe indikátor teploty. Ak po skončení procesu páska autoklávu nesčernie, autokláv nebol dostatočne horúci a budete ho musieť znovu sterilizovať.


PBS skladujte pri izbovej teplote. Po autoklávovaní nechajte PBS vychladnúť na izbovú teplotu a potom utiahnite viečko, aby sa doň nedostali kontaminanty. Utiahnutie viečka pred ochladením fľaše môže vytvoriť podtlak a neskôr veľmi sťažiť odstránenie viečka. PBS je stabilný pri izbovej teplote.[12]

  • PBS môžete tiež alikvotne rozdeliť do menších nádob a použiť po jednom.

Metóda 2 z 3:Vytvorenie 10x zásoby


Zozbierajte si materiály a prísady. Výroba 10X (desaťnásobok bežne používanej koncentrácie) zásoby je takmer totožná s výrobou 1X zásoby, jednoducho pridáte desaťnásobné množstvo chemikálií. Na výrobu 10X zásoby budete potrebovať 1 L odmerný valec, váhy, 2 L kadičku, miešadlo, miešacie dosky, pH meter, autokláv a sklenenú fľašu na skladovanie.[13]
Na výrobu 1 l budete potrebovať nasledujúce množstvá jednotlivých zlúčenín: [14]

  • 700 ml destilovanej vody
  • 80 g NaCl (chlorid sodný)
  • 2 g KCl (chlorid draselný)
  • 14.4 g Na2HPO4 (fosforečnan disodný)
  • 2.4 g KH2PO4 (fosforečnan draselný)
  • Budete tiež potrebovať malé množstvo HCl a/alebo NaOH na stanovenie pH konečného roztoku.
  • Konečné koncentrácie jednotlivých zlúčenín v 10x roztoku sú 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, a 18 mM KH2PO4.


Umiestnite kadičku na vrch miešacej dosky a pridajte miešadlo. Aby ste pomohli rýchlemu rozpusteniu, použite miešadlo a miešaciu dosku, aby sa roztok neustále pohyboval. Pred začiatkom umiestnite miešadlo do prázdnej kadičky, aby ste zabránili postriekaniu.[15]

  • Pred zapnutím miešacej dosky počkajte, kým sa v kadičke objaví roztok.


Odmerajte 700 ml destilovanej vody do 2-litrovej kadičky, potom zapnite miešacie zariadenie. Chcete začať s menším objemom, ako je konečný objem, pretože objem sa bude meniť, keď doň budete pridávať zlúčeniny. Po pridaní a rozpustení všetkého pridáte zvyšok vody, aby ste dosiahli celkový objem 1 l. Odmerajte 700 ml vody odmerným valcom a nalejte ju priamo do čistej kadičky.[16]

  • Po pridaní vody zapnite miešaciu dosku na strednú rýchlosť. Mali by ste vidieť, ako sa vo vode vytvorí malý vír, keď sa miešacia tyč začne otáčať.


Odvážte správne množstvo každej chemikálie. Odvážte 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, a 2.4 g KH2PO4. Odvážte každú chemickú látku jednotlivo v ich vlastnej hmotnostnej lodičke.[17]

  • Ak pridáte príliš veľa chemikálie, jednoducho odstráňte prebytok, kým nebudete mať správne množstvo.


Rozpustite všetky chemikálie v roztoku. Počas miešania pridajte každú chemickú látku do vody. Nie je stanovené žiadne špeciálne poradie pridávania jednotlivých látok, takže môžete pridať všetko naraz. Pokračujte v miešaní, kým sa všetok prášok úplne nerozpustí.[18]

  • Rozpúšťanie bude trvať aspoň 5 až 10 minút, preto ho nechajte premiešať a skontrolujte ho neskôr.


Uistite sa, že pH roztoku je 7.4. Keď je všetko úplne rozpustené, musíte skontrolovať pH pufra a upraviť ho na 7.4.[19]
Miešadlo nechajte zapnuté a ponorte hrot pH-metra do hornej časti roztoku. Nechajte čísla na pH-metri zastaviť, aby ste zmerali aktuálne pH. Roztok bude pravdepodobne príliš kyslý, takže budete musieť pridať hydroxid sodný (NaOH), aby bol zásaditejší.

  • Pomocou malej pipety pridávajte NaOH po niekoľkých kvapkách. Po každom pridaní nechajte roztok chvíľu miešať a počkajte, kým sa čísla prestanú pohybovať. Pokračujte v pridávaní NaOH, kým nedosiahnete hodnotu 7.4.
  • Stanovenie pH roztoku je proces, ktorý si vyžaduje trpezlivosť. Ak náhodou prekročíte hodnotu 7.4 môžete pridať niekoľko kvapiek kyseliny chlorovodíkovej (HCl), aby ste ho znížili.


Pridajte vodu, aby bol konečný objem 1 liter. So správne upraveným pH doplňte roztok na konečný objem 1 liter. Opatrne prelejte celý roztok z kadičky do odmerného valca s objemom 1 l. Pridajte toľko destilovanej vody, aby bol objem 1 l.[20]

  • Konečný roztok nalejte do sklenenej fľaše s objemom 1 l, ktorá je vhodná na autoklávovanie.


Na sterilizáciu roztoku použite autokláv. Nasaďte viečko na fľašu, ale nezaskrutkujte ho úplne nadol. Pri autoklávovaní vzniká para, ktorá môže spôsobiť nárast tlaku vo fľaši. Ak sa viečko utiahne, fľaša môže vybuchnúť. Použite pás autoklávovacej pásky cez veko, aby držalo na mieste počas autoklávovania.[21]

  • Nastavte autokláv na 20 minút sterilizácie pri tlaku 15 psi v cykle kvapaliny.[22]
  • Autoklávovacia páska má v sebe indikátor teploty. Ak dosiahne správnu teplotu, páska sčernie. Ak páska nesčernie, autokláv nebol dostatočne horúci a budete musieť vykonať novú sterilizáciu.


PBS uchovávajte pri izbovej teplote. Po autoklávovaní nechajte PBS úplne vychladnúť pred utiahnutím veka. Ak utiahnete veko, kým je ešte horúce, môže sa vytvoriť podtlak, ktorý neskôr veľmi sťaží jeho odstránenie. PBS je dlhodobo stabilný pri izbovej teplote.[23]

  • PBS môžete tiež alikvotne rozdeliť do menších nádob a použiť ho po jednom.

Metóda 3 z 3: Riedenie 10X zásoby na 1X


Určite množstvo 1X roztoku, ktoré budete potrebovať. Najprv musíte vedieť, koľko 1X zásoby chcete, aby ste mohli vypočítať, koľko 10X zásoby budete potrebovať. Množstvo, ktoré treba pripraviť, bude závisieť od typu experimentu, ktorý robíte.

  • Ak potrebujete len alikvotnú časť 1X zásoby, aby ste ju mali poruke, pripravte si približne 500 ml. Tento 1X vývar môžete používať určitý čas a nebudete ho musieť vyrábať tak často.


Vypočítajte potrebné množstvo 10X zásoby. Na výpočet potrebného množstva 10X zásoby jednoducho vydelíte celkový objem 10.[24]
Nezabudnite, že na získanie správneho objemu sa musia zhodovať vaše jednotky: ak je objem, ktorý vytvárate, v mililitroch, objem, ktorý pridáte, bude v mililitroch.

  • Napríklad: Ak chcete 500 ml roztoku, vydeľte 500 číslom 10 a dostanete 50 ml. Potrebujete 50 ml 10X zásoby na výrobu 500 ml 1X.
  • Napríklad: Ak chcete 2 l roztoku, vydeľte 2/10 a dostanete 0.2 L. Tento objem môžete prepočítať na ml vynásobením 1000. Potrebujete 200 ml 10x zásoby na výrobu 2 l 1X.


Od celkového objemu odčítajte objem 10x. Na určenie množstva vody potrebnej na zriedenie 10X zásoby stačí od celkového objemu, ktorý chcete, odčítať vypočítaný 10X objem.[25]

  • Napríklad: Na výrobu 500 ml potrebujete 50 ml 10x zásobného roztoku. Keďže 500 – 50 = 450, potrebujete 450 ml destilovanej vody na zriedenie roztoku.


Zrieďte 10X zásobu destilovanou vodou. Pomocou vypočítaných objemov pridajte destilovanú vodu do 10x zásoby. Teraz ste si pripravili 1X zásobu PBS.[26]

  • Napríklad pridajte 50 ml 10x zásoby do 450 ml destilovanej vody, aby ste vytvorili 1x zásobu PBS. Nádobu otáčajte, aby sa roztok premiešal.

  • Skontrolujte pH 1X zásoby. Niekedy proces riedenia ovplyvňuje pH pufru. Je rozumné skontrolovať pH 1X zásoby a uistiť sa, že je na úrovni 7.4 nasledujúce riedenie.[27]

    • Pomocou pH-metra zmerajte pH a pomocou HCl alebo NaOH upravte pufr na pH 7.4.
  • Odkazy