4 spôsoby identifikácie baktérií

Vo väčšine prípadov sa identifikácia baktérií vykonáva vylučovacím procesom s cieľom zúžiť výber, kým sa nedostanete k tej správnej. Urobiť to správne je neuveriteľne zložitý proces, čiastočne preto, že existuje veľmi veľa druhov – niektorí vedci odhadujú, že počet druhov baktérií môže byť viac ako miliarda! Aj keď si môžete vybrať z toľkých možností, identifikácia je dôležitá najmä v klinickom a lekárskom prostredí. Aby to bolo jednoduchšie, existujú normy na identifikáciu, ktoré vychádzajú z použitia techník farbenia na preskúmanie vzhľadu baktérií a pozorovania reakcií baktérií na rôzne podmienky.

Metóda 1 zo 4:Identifikácia baktérií pomocou farbenia podľa Grama


Použite Farbenie podľa Grama zistiť, či sú baktérie Gram pozitívne alebo Gram negatívne. Gramovo farbenie je postup, ktorý umožňuje rozdeliť baktérie na 2 bežné typy: Gram pozitívne a Gram negatívne. Grampozitívne baktérie majú mimoriadne hrubú bunkovú stenu (z polyméru nazývaného peptidoglykán), ktorá lepšie drží farbivo ako tenšie bunkové steny Gramnegatívnych baktérií.[1]

  • Medzi bežné grampozitívne rody baktérií patria Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus a Listeria.
  • Medzi bežné gramnegatívne rody baktérií patria Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter a Fusobacterium.


Používajte bezpečnostné opatrenia. Baktérie a chemikálie, s ktorými budete pracovať počas postupu farbenia podľa Grama, sú potenciálne nebezpečné. Pri farbení používajte ochranné okuliare, jednorazové nitrilové rukavice a laboratórny plášť. Po skončení práce vložte jednorazové rukavice a akýkoľvek iný kontaminovaný odpad do vreca na biologický odpad. Dodržiavajte postupy vášho laboratória pri likvidácii vreca s biologickým nebezpečenstvom.[2]
Dôveryhodný zdroj
Centrá pre kontrolu a prevenciu chorôb
Hlavný inštitút verejného zdravia pre USA, ktorý riadi ministerstvo. zdravotníctva a sociálnych služieb
Prejsť na zdroj


Urobte si diapozitív so svojou bakteriálnou vzorkou. Ak chcete začať proces, umiestnite malú kvapku alebo kúsok bakteriálnej vzorky na sterilné sklíčko. Sklíčko prejdite 3-krát cez plameň Bunsenovho horáka, aby ste vzorku tepelne zafixovali.[3]
Zabránite tak vyplavovaniu vzorky pri pridávaní činidiel alebo oplachovaní sklíčka.


Pridajte na sklíčko 5 kvapiek kryštálovej violete. Na teplom fixovanú kultúru umiestnite kvapky kryštálovofialového farbiva. Nechajte vzorku namočenú v kryštálovofialovom farbive 1 minútu.[4]

  • Aby ste si nezašpinili ruku, môžete si sklíčko pridržať špendlíkom na šaty.[5]


Jemne opláchnite sklíčko, aby ste odstránili škvrnu. Použite veľmi jemný prúd vody z umývadla alebo striekacej fľaše. Neoplachujte dlhšie ako 5 sekúnd.[6]
Tento proces odstráni akékoľvek farbivo, ktoré nie je viazané na vzorku.


Pridajte 5 kvapiek Gramovho jódu na sklíčko. Gramov jód je roztok jódu, jodidu draselného a hydrogenuhličitanu sodného.[7]
Tento roztok spôsobí, že farbivo kryštálovej violete sa spojí s bunkovými stenami baktérií. Pridajte asi 5 kvapiek a nechajte pôsobiť 1 minútu.[8]


Opláchnite vzorku alkoholom alebo acetónom. Alkohol a acetón sú odfarbovacie činidlá. Ak sú vaše baktérie gramnegatívnym kmeňom, tieto látky odstránia škvrnu z bunkových stien baktérií. Nechajte niekoľko kvapiek odfarbovacieho činidla stiecť na vzorku a nechajte ho pôsobiť najviac 3 sekundy. Jemne oplachujte vodou najviac 5 sekúnd, aby ste odstránili alkohol alebo acetón.[9]

  • Ak necháte odfarbovacie činidlo pôsobiť na vzorku príliš dlho, môže odstrániť farbivo z grampozitívnych baktérií, čo spôsobí falošný gramnegatívny výsledok.


Roztok protifarbite safranínom. Safranín je červené farbivo, ktoré bude pôsobiť ako protifarbivo ku kryštálovej violeti a zafarbí všetky baktérie, ktoré neudržali fialové farbivo. Pridajte do vzorky asi 5 kvapiek roztoku safranínu a nechajte ju 1 minútu pôsobiť. Veľmi jemne oplachujte vodou po dobu 5 sekúnd.[10]


Pozrite si vzorku pod mikroskopom pri 1000-násobnom zväčšení. Ak sú baktérie grampozitívne, budú sa pod mikroskopom javiť fialové alebo purpurové. Gramnegatívne baktérie sa budú javiť červené od safranínového kontrasta.[11]

Metóda 2 zo 4:Použitie Ziehlovej-Neelsenovej metódy farbenia


Na detekciu acidorezistentných baktérií použite farbenie podľa Ziehl-Neelsena. Kyslomilné baktérie obsahujú väčšie množstvo lipidov ako iné typy baktérií, vďaka čomu sú odolné voči farbiacim prostriedkom používaným pri farbení podľa Grama. Kyslomilné baktérie patria do rodu Mycobacterium, ktorý zahŕňa baktériu spôsobujúcu tuberkulózu (M. tuberkulóza). Kyslomilné baktérie sa môžu farbiť červeným karbol-fuchsínovým farbivom, ktoré odolá opláchnutiu kyslým alkoholom alebo roztokom kyseliny sírovej.[12]


Prijmite správne bezpečnostné opatrenia. Chemikálie a biologické materiály používané počas postupu farbenia podľa Ziehla-Neelsena môžu byť nebezpečné. Budete používať aj zdroje tepla, ako je Bunsenov horák, liehová lampa alebo elektrický ohrievač sklíčok. Pri vykonávaní tohto postupu dodržiavajte nasledujúce bezpečnostné opatrenia: [13]

  • Noste ochranné okuliare, nitrilové rukavice a laboratórny plášť.[14]
  • Dávajte pozor, aby ste nevdýchli výpary z farbiacich a odfarbovacích roztokov, ani aby sa vám nedostali na pokožku alebo do očí. Všetky otvorené nádoby uchovávajte pod digestorom.[15]
  • Pri ohrievaní diapozitívov buďte veľmi opatrní, pretože mnohé chemikálie, ktoré budete používať, sú horľavé. Na stojanoch na sklíčka a inom vybavení môžu byť stopy horľavých chemikálií.[16]


Pripravte si sklíčko. Krúživými pohybmi rovnomerne rozotrite náter vašej vzorky na stred sterilného sklíčka. Váš náter by mal byť veľký asi 10 mm (0.4 palce) o 20 mm (0.8 palcov).[17]


Osušte si preparát. Umiestnite sklíčko na sušiaci stojan rozmazanou stranou nahor. Nechajte ju 30 minút schnúť na vzduchu.[18]
Nepokúšajte sa sklíčko vysušiť.


Tepelne upravte svoj náter. Vzorku môžete tepelne upraviť tak, že sklíčko 2-3-krát prejdete nad plameňom Bunsenovho horáka, náterovou stranou nahor. Prípadne umiestnite sklíčko na elektrický ohrievač sklíčok pri teplote 65° – 75° C (149° – 167° F) aspoň na 2 hodiny.[19]
Dávajte pozor, aby ste vzorku nespálili alebo nezavarili.


Na sklíčko pridajte farbivo karbol-fuchsín. Na sklíčko naneste niekoľko kvapiek roztoku karbol-fuchsínu. Pridajte toľko, aby ste úplne pokryli náter.[20]


Nahrejte zafarbené sklíčko, aby sa farbivo fixovalo na náter. Sklíčko jemne zahrejte nad Bunsenovým horákom alebo liehovou lampou, rozmazanou stranou nahor, alebo ho položte na elektrický ohrievač sklíčok. Zahrievajte sklíčko, kým nedosiahne teplotu 60 °C (140 °C). Mali by ste vidieť, že para začína stúpať. Nechajte zohriate farbivo na sklíčku 5 minút.[21]

  • Ak používate elektrický ohrievač sklíčok, nastavte ho na 60 °C (140 °C). Ak používate Bunsenov horák alebo liehovú lampu, musíte pozorne sledovať, či sa neobjaví para alebo výpary.
  • Aby ste sklíčko udržali pri požadovanej teplote celých 5 minút, aplikujte teplo s prestávkami.[22]
  • Dbajte na to, aby ste zafarbenú škvrnu nevyvarili, nespálili alebo úplne nevysušili.


Opláchnite sklíčko studenou vodou. Sklíčko nechajte asi 5 minút vychladnúť a potom ho niekoľko sekúnd veľmi opatrne oplachujte čistou vodou z kohútika alebo stláčacej fľaše, aby ste odstránili všetky škvrny, ktoré nie sú spojené so vzorkou.[23]


Prekryte náter kyslým alkoholom alebo kyselinou sírovou. Pridajte dostatočné množstvo 3 % objemových (v/v) kyslého alkoholu alebo 20 % kyseliny sírovej na úplné pokrytie náteru. Nechajte kyselinu na sklíčku, kým škvrna nevybledne na veľmi bledoružovú.[24]
Toto zvyčajne trvá najmenej 10 minút.[25]


Sklíčko opláchnite čistou vodou. Jemne opláchnite vodou z kohútika alebo stláčacou fľašou, pričom sa uistite, že ste zmyli všetky kyseliny a zvyšné stopy farbiva.[26]


Na sklíčko pridajte protifarbivo. Po opláchnutí sklíčka zakryte farbivo roztokom malachitovej zelene alebo Loefflerovej metylénovej modrej. Tieto roztoky vytvárajú zelené alebo modré „pozadie“, ktoré pomáha vyniknúť červeno zafarbeným baktériám, a zafarbia aj akýkoľvek iný biologický materiál na podložnom sklíčku (napríklad ľudské bunky a baktérie, ktoré nie sú kyslomilné). Nechajte farbivo odstáť 1 – 2 minúty.[27]


Opláchnite a vysušte sklíčko. Sklíčko jemne umyte čistou vodou, aby ste odstránili prebytočné protifarbivo. Po skončení utrite zadnú stranu sklíčka čistou handričkou a umiestnite sklíčko na stojan, aby vyschlo na vzduchu.[28]


Sklíčko preskúmajte pod mikroskopom pri 1000-násobnom zväčšení. Kyslomilné baktérie by sa mali objaviť červené alebo horúco ružové. Nekyslé baktérie, nebakteriálne bunky a pozadie sa budú javiť modré alebo zelené.[29]

Metóda 3 zo 4:Pozorovanie vzhľadu a správania baktérií


Pozorujte tvar baktérií. Keď ste pomocou farbenia určili, či sú vaše baktérie Gram pozitívne, Gram negatívne alebo acidorezistentné, je čas zúžiť typ baktérií. Prvým krokom je pozorovanie tvaru(ov) baktérií na sklíčku. 3 najbežnejšie tvary sú kokus (guľovitý), bacil (tyčinkovitý) a špirála.[30]

  • Existuje množstvo variácií všetkých týchto tvarov. Napríklad baktérie kokov sa môžu objaviť v rôznych formáciách, ako sú zrastené páry (diplokoky), reťazce, zhluky alebo skupiny po 4 (tetrády).


Určite, či sú baktérie aeróbne alebo anaeróbne. Odoberte 2 vzorky baktérií a vytvorte 2 samostatné kultúry. 1 kultúra by mala byť anaeróbna (pestovaná bez kyslíka) a druhá by mala byť aeróbna (pestovaná s kyslíkom). Pred pokusom o pozorovanie rastu baktérií uchovávajte anaeróbnu kultúru v prostredí bez prístupu kyslíka pri teplote 35 °C (95 °C) najmenej 48 hodín.[31]

  • Ak vaše baktérie rastú v prostredí bez kyslíka, ale nie pri vystavení kyslíku, sú anaeróbne.
  • Baktérie, ktoré rastú, keď sú vystavené kyslíku, ale nie, keď sú držané v prostredí bez kyslíka, sú aeróbne.
  • Baktérie, ktoré môžu rásť v oboch prostrediach, sa nazývajú fakultatívne anaeróby.


Urobte test pohyblivosti, aby ste zistili, či sú vaše baktérie pohyblivé. Pohyblivé baktérie sa môžu pohybovať samy pomocou 1 alebo viacerých bičíkov, ktoré ich poháňajú. Pohyblivosť alebo jej nedostatok môže byť dôležitým faktorom pri identifikácii kmeňa baktérií.[32]
Existuje niekoľko typov testov motility, ale test na polotuhom médiu je najbezpečnejší a najjednoduchší na odčítanie.


Vytvorte kultúru na test pohyblivosti. Pripravte kultúru baktérií v živnom bujóne. Pripravte bujón podľa pokynov pre vami preferované bujónové médium.[33]


Naočkujte skúmavku s polotuhým agarom na motilitu vašou kultúrou. Sterilnú očkovaciu ihlu potiahnite časťou bujónovej kultúry. Opatrne zapichnite ihlu priamo do skúmavky s polotuhým agarom určeným na testovanie pohyblivosti (napríklad TTC agar). Ihla by sa mala dostať asi do 2/3 agaru.[34]

  • Keď skončíte, opatrne vytiahnite ihlu, pričom dávajte pozor, aby ste neporušili pôvodnú „bodnú líniu.“
  • Inkubujte skúmavku pri teplote 30 °C (86 °C) počas 48 hodín.[35]


Odčítajte výsledky testu pohyblivosti. Pohyblivý agar sa pri kontakte s baktériami sfarbí do červena. Ak sú vaše baktérie pohyblivé, v celom agare sa rozptýli červená alebo ružová farba. Ak sú nemotorné, uvidíte len červenú farbu pozdĺž pôvodnej bodovej čiary.[36]

Metóda 4 zo 4:Dávať všetko dokopy


Zostavte si svoje pozorovania. Na zúženie rodu baktérií budete musieť skombinovať informácie z vašich škvŕn, kultúr a pozorovaní tvaru baktérií. Ak testujete kultiváciu od pacienta, informácie o jeho príznakoch môžu byť tiež užitočné na zúženie oblasti.

  • Ak napríklad vaše testy odhalia, že vaše baktérie sú Gram negatívne, anaeróbne, nepohyblivé tyčinky a u pacienta sa spájajú s bolesťou brucha, nevoľnosťou a vracaním, pravdepodobne ide o Bacteroides fragilis.[37]


Nahliadnite do databázy baktérií. Keďže existuje veľmi veľa druhov baktérií, je nemožné zapamätať si alebo rozpoznať ich všetky samostatne. Pravdepodobne budete musieť nahliadnuť do učebnice klinickej mikrobiológie alebo do online databázy a vyhľadať baktérie so všetkými charakteristikami vašej vzorky.

  • Medzi dobré online zdroje na identifikáciu baktérií patrí Pathosystems Resource Integration Center (patricbrc.org) a databázu patogénnych baktérií na stránke GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).

  • Použitie genetického testovania na určenie presného druhu baktérie. V niektorých prípadoch môže byť potrebné presne určiť druh baktérie. Najrýchlejší a najefektívnejší spôsob, ako to urobiť, je testovanie DNA. Testovanie DNA je tiež užitočné pri identifikácii baktérií, ktoré odolávajú tradičným formám kultivácie alebo farbenia.[38]
    Moderné testovanie mikrobiálnej DNA sa dá vykonať veľmi rýchlo, niekedy už za 2 hodiny.[39]

    • Ak nemáte prístup k laboratóriu, ktoré vykonáva sekvenovanie mikrobiálneho genómu, pošlite vzorku do špecializovaného zariadenia, napríklad MIDI Labs alebo CD Genomics.
  • Odkazy