Ako urobiť spektrofotometrickú analýzu: 13 krokov (s obrázkami)

Spektrofotometria je experimentálna technika, ktorá sa používa na meranie koncentrácie rozpustených látok v určitom roztoku výpočtom množstva svetla absorbovaného týmito rozpustenými látkami.[1]
Táto technika je účinná, pretože určité zlúčeniny absorbujú rôzne vlnové dĺžky svetla s rôznou intenzitou. Analýzou svetla, ktoré prechádza roztokom, môžete určiť konkrétne rozpustené látky v roztoku a ich koncentráciu. Spektrofotometer je zariadenie, ktoré sa používa na analýzu roztokov v laboratórnych výskumných podmienkach.

Časť 1 z 3:Príprava vzoriek


Zapnite spektrofotometer. Väčšina spektrofotometrov sa musí zahriať, aby mohli poskytnúť presné údaje. Pred spustením vzoriek zapnite prístroj a nechajte ho aspoň 15 minút v pokoji.

  • Čas na zahriatie využite na prípravu vzoriek.


Vyčistite kyvety alebo skúmavky. Ak robíte laboratórium pre školu, môžete používať jednorazové skúmavky, ktoré sa nemusia čistiť. Ak používate kyvety alebo skúmavky na opakované použitie, uistite sa, že sú pred použitím riadne vyčistené. Každú kyvetu dôkladne vypláchnite deionizovanou vodou.

  • Dávajte pozor na kyvety, pretože môžu byť dosť drahé, najmä ak sú vyrobené zo skla alebo kremeňa. Kremenné kyvety sú určené na použitie v UV-viditeľnej spektrofotometrii.
  • Pri manipulácii s kyvetou sa nedotýkajte strán, cez ktoré bude prechádzať svetlo (spravidla priehľadné strany nádoby).[2]
    Ak sa náhodou dotknete týchto strán, utrite kyvetu kimovovou utierkou (ktoré sú vyrobené tak, aby zabránili poškriabaniu skla).


Vložte do kyvety správny objem vzorky. Niektoré kyvety majú maximálny objem 1 mililiter (ml), zatiaľ čo skúmavky môžu mať maximálny objem 5 ml. Pokiaľ laser produkujúci svetlo prechádza cez kvapalinu, a nie cez prázdnu časť nádoby, získate presný údaj.

  • Ak používate na vkladanie vzoriek pipetu, použite pre každú vzorku novú špičku, aby ste zabránili krížovej kontaminácii.[3]


Pripravte si kontrolný roztok. Kontrolný roztok, známy ako slepá vzorka, obsahuje len chemické rozpúšťadlo, v ktorom je rozpustená analyzovaná látka. Napríklad, ak by ste mali vo vode rozpustenú soľ, vaša slepá vzorka by bola len voda. Ak vodu zafarbíte na červeno, slepý pokus musí tiež obsahovať červenú vodu. Slepý pokus má rovnaký objem ako analyzovaný roztok a uchováva sa v rovnakom druhu nádoby.


Utrite vonkajšiu stranu kyvety. Pred vložením kyvety do spektrofotometra sa chcete uistiť, že je čo najčistejšia, aby ste zabránili interferencii s nečistotami alebo prachovými časticami. Pomocou handričky, ktorá nepúšťa vlákna, odstráňte všetky kvapky vody alebo prach, ktoré môžu byť na vonkajšej strane kyvety.[4]

Časť 2 z 3: Spustenie experimentu


Vyberte a nastavte vlnovú dĺžku svetla, ktorým sa má vzorka analyzovať. Použite jednu vlnovú dĺžku svetla (monochromatickú farbu), aby bolo testovanie efektívnejšie. Zvolená farba svetla by mala byť taká, o ktorej je známe, že ju absorbuje jedna z chemických látok, o ktorých sa predpokladá, že sa nachádzajú v testovanom roztoku. Nastavte požadovanú vlnovú dĺžku podľa špecifikácií vášho spektrofotometra.

  • V laboratóriu v triede vám bude pravdepodobne daná vlnová dĺžka.
  • Keďže vzorka bude odrážať všetko svetlo rovnakej farby, ako sa objaví, experimentálna vlnová dĺžka bude mať vždy inú farbu ako vzorka.
  • Objekty sa javia ako určité farby, pretože odrážajú svetlo určitých vlnových dĺžok a absorbujú všetky ostatné farby. Tráva je zelená, pretože chlorofyl v nej odráža zelené svetlo a absorbuje všetko ostatné.


Kalibrujte prístroj pomocou slepej vzorky. Umiestnite slepú vzorku do držiaka kyvety a zatvorte veko. Na analógovom spektrofotometri bude obrazovka s ručičkou, ktorá sa pohybuje na základe intenzity detekcie svetla. Keď je polotovar vložený, mali by ste vidieť, že sa ihla posúva doprava. Zaznamenajte si túto hodnotu pre prípad, že by ste ju neskôr potrebovali. Keď je slepá vzorka stále v prístroji, nastavte ručičku na nulu pomocou nastavovacieho gombíka.

  • Digitálne spektrofotometre sa dajú kalibrovať rovnakým spôsobom, len budú mať digitálny odpočet. Pomocou nastavovacích gombíkov nastavte prázdnu nádobu na hodnotu 0.
  • Keď vyberiete slepý pokus, kalibrácia bude stále na mieste. Pri meraní ostatných vzoriek sa automaticky odpočíta absorbancia zo slepého pokusu.
  • Nezabudnite použiť jeden slepý pokus na jednu reláciu, aby sa každá vzorka kalibrovala podľa toho istého slepého pokusu. Ak napríklad spektrofotometer zaslepíte, potom analyzujete len niektoré vzorky a opäť ho zaslepíte, zvyšné vzorky budú nepresné. Museli by ste začať odznova.


Vyberte slepú vzorku a otestujte kalibráciu. Po vybratí slepého pokusu by mala ručička zostať na hodnote 0 (nula) alebo digitálny ukazovateľ by mal naďalej ukazovať hodnotu 0. Vložte slepú vzorku späť do prístroja a uistite sa, že sa ihla alebo odčítanie nezmení. Ak je prístroj správne kalibrovaný s vašou prázdnou vzorkou, všetko by malo zostať na hodnote 0.

  • Ak ručička alebo odčítanie nemá hodnotu 0, zopakujte kalibračné kroky s prázdnym materiálom.
  • Ak máte naďalej problémy, vyhľadajte pomoc alebo nechajte prístroj skontrolovať z hľadiska údržby.


Zmerajte absorbanciu vašej experimentálnej vzorky. Odstráňte slepú vzorku a vložte experimentálnu vzorku do prístroja. Zasuňte kyvetu do určenej drážky a uistite sa, že stojí vzpriamene. Počkajte približne 10 sekúnd, kým sa ručička ustáli alebo kým sa digitálne čísla neprestanú meniť. Zaznamenajte hodnoty % priepustnosti a/alebo absorbancie.

  • Absorbancia je známa aj ako optická hustota (OD).
  • Čím viac svetla prechádza, tým menej svetla vzorka absorbuje. Vo všeobecnosti chcete zaznamenať hodnoty absorbancie, ktoré sa zvyčajne uvádzajú ako desatinné číslo, napríklad 0.43.
  • Ak získate odľahlý výsledok (napr. 0.900, keď sa ostatné hodnoty pohybujú okolo 0.400), zrieďte vzorku a znova zmerajte absorbanciu.
  • Zopakujte odčítanie pre každú jednotlivú vzorku aspoň 3-krát a spriemerujte ich spolu. Tým sa zabezpečí presnejšie odčítanie.


Opakujte test s postupnými vlnovými dĺžkami svetla. Vaša vzorka môže obsahovať viacero neznámych zlúčenín, ktorých absorbancia sa bude líšiť v závislosti od vlnovej dĺžky. Aby ste eliminovali neistotu, opakujte svoje merania v intervaloch po 25 nm v celom spektre. To vám umožní zistiť ďalšie chemické látky, o ktorých sa predpokladá, že sú v rozpustenej látke.

Časť 3 z 3:Analýza údajov o absorbancii


Vypočítajte transmitanciu a absorbanciu vzorky. Priepustnosť je to, aká časť svetla, ktorá prešla vzorkou, sa dostala do spektrofotometra. Absorbancia vyjadruje, akú časť svetla absorbovala jedna z chemických látok v rozpustenej látke. Mnohé moderné spektrofotometre majú výstup transmitancie a absorbancie, ale ak ste zaznamenali intenzitu, môžete tieto hodnoty vypočítať.[5]

  • Priepustnosť (T) sa zistí vydelením intenzity svetla, ktoré prešlo cez roztok vzorky, množstvom svetla, ktoré prešlo cez slepú vzorku. Zvyčajne sa vyjadruje ako desatinné číslo alebo percento. T = I/I0 kde I je intenzita vzorky a I0 je intenzita prázdnej vzorky.
  • Absorpcia (A) sa vyjadruje ako záporná hodnota logaritmu (exponentu) základu 10 hodnoty transmitancie: A = -log10T.[6]
    Pre hodnotu T 0.1, hodnota A je 1 (0.1 je 10 na mocninu -1), čo znamená, že 10 % svetla prechádza a 90 % sa absorbuje. Pre hodnotu T 0.01, hodnota A je 2 (0.01 je 10 na -2 mocniny), čo znamená, že 1 % svetla je prepustené.


Zakreslite hodnoty absorbancie v závislosti od vlnovej dĺžky do grafu. Hodnota absorbancie je vynesená na vertikálnej osi y oproti vlnovej dĺžke svetla použitého na danú skúšku vynesenej na horizontálnej osi x. Vynesením maximálnych hodnôt absorbancie pre každú vlnovú dĺžku testovaného svetla sa vytvorí absorpčné spektrum vzorky a identifikujú sa zlúčeniny tvoriace testovanú látku a ich pomer.

  • Absorpčné spektrum má zvyčajne vrcholy pri určitých vlnových dĺžkach, ktoré vám umožnia identifikovať konkrétne zlúčeniny.

  • Porovnajte graf absorpčného spektra so známymi grafmi špecifických zlúčenín. Zlúčeniny majú jedinečné absorpčné spektrum a pri každom meraní vždy vytvoria pík pri rovnakej vlnovej dĺžke. Porovnaním grafov neznámych zlúčenín s grafmi známych zlúčenín môžete identifikovať rozpustené látky, ktoré tvoria váš roztok.

    • Túto metódu môžete použiť aj na identifikáciu kontaminantov vo vzorke. Ak očakávate 1 jasný pík pri určitej vlnovej dĺžke a dostanete 2 píky pri rôznych vlnových dĺžkach, viete, že vo vašej vzorke niečo nie je v poriadku.
  • Odkazy